A szôlô agrobaktériumos betegségét két baktérium idézheti elô: az Agrobacterium vitis és az Agrobacterium tumefaciens. A két baktérium, közeli rokonságuk ellenére, számos tulajdonságában különbözi

Hirdetés

Agrobaktériumos fertőzéstől mentes szőlő-szaporítóanyag előállítása

Szegedi Ernô és Süle Sándor
Hirdetés

Iratkozz fel Te is Youtube csatornánkra, kattints az alábbi YOUTUBE ikonra! 

 

 

A szôlô agrobaktériumos betegségét két baktérium idézheti elô: az Agrobacterium vitis és az Agrobacterium tumefaciens. A két baktérium, közeli rokonságuk ellenére, számos tulajdonságában különbözik egymástól. A szôlôn az esetek többségében az A. vitis (Burr és mtsai 1998, Burr és Otten 1999) és csak kisebb mértékben az A. tumefaciens károsít (Szegedi és mtsai 2005). A betegség Magyarországon dokumentálhatóan az 1960-as évektôl kezdve rendszeresen fellép (Lehoczky 1968a, Süle 1978), és súlyos károkat okoz. Hazánkon kívül szinte mindenütt elôfordul, ahol szôlôt termesztenek. A kártétel megelôzése szempontjából kulcsfontosságú az egészséges, baktériumfertôzéstôl mentes szaporítóanyag felhasználása. Különösen nagy veszélyt jelent a látens fertôzés, mivel kiszûrése rendkívül nehéz.
Agrobaktériumos fertőzéstől mentes szőlő-szaporítóanyag előállítása

Az egészséges szaporítóanyag elôállításának legegyszerûbb és talán leghatásosabb módja a törzsültetvények folyamatos megfigyelése és többlépcsôs ellenôrzése  (Németh  1990).  Alapvetô,  hogy  az  ültetvény  fertôzésmentességére  vonatkozólag  visszamenôleg legalább öt évre megbízható adataink legyenek. Lehoczky János megfigyelései  alapján  ugyanis  a  látensen  fertôzött  tôkék még nyolc év eltelte után is tumorossá válhatnak.

A fertôzésmentesség bizonyítására a leghatásosabb  mód,  ha  az  ültetvényt  rendszeresen alaposan átjárjuk, és szemügyre vesszük a tôketörzseket. Ha az ültetvényben legalább öt éven keresztül nem látunk beteg tôkéket, akkor nagy valószínûséggel  állíthatjuk,  hogy  az  ültetvény agrobaktérium-mentes. Ha további megerôsítésekre  van  szükségünk,  akkor  különbözô  termesztéstechnikai és növénykórtani módszerekkel bizonyíthatjuk azt. Ennek egyik módja a negatív szelekció, melynek az a lényege, hogy a szaporítóanyagtermesztés  folyamatának  lehetôleg  több  lépésében  ellenôrizzük  a  kiindulási anyagot,  másrészt,  hogy  valamilyen  technológiai  eljárással,  kezeléssel  baktériummentes anyagot állítunk elô a szaporításra szánt tételekbôl. Az újonnan telepített szôlôültetvények fertôzôdésének megelôzésére alapvetô fontosságú, hogy olyan területre ne telepítsünk szôlôt, ahol korábban golyvás ültetvény volt, mivel a talajban  maradt  gyökerekben  a  baktérium  évekig fennmaradhat (Burr és mtsai 1995).

A) Lehetôségek a szaporítóanyag diagnosztikai vizsgálatára

A fertôzés kimutatása ültetvényekbôl: könnyezésinedv-analízis és opin teszt segítségével


Az  agrobaktérium  kimutatásának  elsô  lép- csôje  az  üzemi  törzsültetvények  vizsgálata  a szaporítóanyag gyûjtést  megelôzôen.  A  vizuális, tüneti szelekció mellett ennek egyik lehetséges módja, hogy a vegetációs idôszak kezdetekor  (Magyarországon  általában  áprilisban),  a nedvkeringés  megindulása  után  a  könnyezési nedvet vizsgáljuk a patogén baktérium jelenlétére  vonatkozólag. 

A  szôlô  könnyezési  nedve, kémiai  összetételét  tekintve,  tápanyagokban rendkívül  gazdag,  így  megfelelô  hômérséklet esetén ideális közeg az endogén mikrobióta számára. A könnyû és egyszerû mintavételi lehetôség mellett ez nagymértékben elôsegíti a szôlôben élô baktériumok izolálását és azonosítását. Tudomásunk szerint szôlô könnyezési nedvébôl elôször Lehoczky János mutatta ki az agrobaktériumot. A nyolcéves golyvás „Afuz Ali” tôkék egy-két éves vesszôinek internodiális részébôl gyûjtött mintákban milliliterenként 4,7–9,3 X104 baktériumsejtet talált, melyek három–öt morfológiailag különbözô csoportot alkottak.  Az  agrobaktérium  becsült  sejtszáma 7,0–15 X103/ml volt. A vizsgált 9 tôke könnye zési  nedvének  mintáiból  16  agrobaktérium-szerû telepet izolált, amelyekbôl négy telep bizonyult  patogénnek  napraforgón  (Lehoczky 1968b). Az Egyesült Államokban 19 szôlôfajta 24 golyvás és 17 tünetileg egészséges tôkéjébôl gyûjtöttek és vizsgáltak könnyezésinedv-mintákat agrobaktérium-tartalomra, különbözô táptalajokon  történô  kitenyésztéssel.  A 24 golyvás tôkérôl gyûjtött mintából hét tartalmazott virulens  A.  tumefacienst,  a  17  egészséges  tôkérôl származó  könnyezésinedv-minták  közül  pedig csak egybôl volt kimutatható a patogén.

Tíz telep biokémiai, és patogenitástesztekkel történô jellemzése alapján valamennyi A. vitis volt. Ennek alapján, ha kis százalékban is, de kimutatták a látens fertôzést egészséges tôkékbôl is (Burr és Katz 1983). Iráni kutatók fertôzött tôkékrôl származó  szôlôkönnyezési  nedvbôl,  tumorok- ból és talajból összesen 32 agrobaktérium-tele- pet izoláltak. Ezek közül 22 telep A. vitis, 6 telep A.  tumefaciens és 4 telep  pedig  A.  rhizogenes volt. Az izolált telepek közül 7 volt patogén, és mindegyikük  könnyezési  nedvbôl  származott (Mohammadi és Fatehi-Paykani 1999). A mintákat  közvetlenül a tünet feletti  többéves fás részbôl  gyûjtötték.  Magyarországon  18  éves Rajnai  rizling  és Cabernet  Sauvignon tôkéket vizsgáltunk.  Az  egyéves  vesszôkbôl gyûjtött könnyezési nedvbôl szénforrásként tartarátot tartalmazó félszelektív táptalajon tenyésztettük ki az A. vitist.

Az izolált telepeket PCR-rel és patogenitásteszttel  azonosítottuk.  A hat  tünetmentes  növényrôl  származó  minta  közül  egy tartalmazott patogén A. vitist. A tíz golyvás tôke mintáiból kettô volt pozitív, tehát ezekbôl is hasonló arányban lehetett izolálni virulens baktériumsejteket (Szegedi és Bottka 2002). Ezek az eredmények megközelítôen megegyezôek a korábban kapott adatokkal (Lehoczky 1968b, Burr és Katz 1983). Pu és Goodman (1993b) elôzetesen  tesztelt  agrobaktérium-mentes  növényeket ültettek ki szabadföldi körülmények közé, olyan területre, ahol korábban erôsen fertôzött szôlôk voltak. Mintegy két év után áprilisban gyûjtött könnyezési  nedvbôl  kiindulva,  a  vizsgált  255 növénybôl  135-ben  (53%)  találtak  agrobaktériumot. Stover és munkatársai (1997) üvegházi kísérletben a fertôzést követôen egy évvel a nö- vényeknek mintegy 5,3%-ából tudták kimutatni az A. vitist.

Ez arra utal, hogy az adott kísérleti körülmények között a baktérium lassan és egyenetlenül terjed a szôlôxylemben. Németország- ban 1986 és 1987 tavaszán nagyszámú, mintegy 70 mintával végzett vizsgálat során nem találtak a szôlô könnyezési nedvében patogén agrobak- tériumot  (Jäger  és  mtsai  1990).  A  könnyezési nedv analízise a fenti ellentmondásos eredmények  következtében csak  részben alkalmas a fertôzés biztonságos kimutatására. A módszer a vegetációs  idôszak  kezdetekor használható az ültetvények agrobaktérium-fertôzöttségének az ellenôrzésére, de számolni kell azzal, hogy a ki- mutathatóság  nem 100%-os.  Ezért  nagyszámú minta vizsgálatára van szükség, és egy-egy tôkérôl is érdemes különbözô pontokról (eltérô edénynyalábokból) mintát venni. Ezzel jelentôs mértékben növelhetô a vizsgálati eredmények megbízhatósága.

Az  agrobaktérium  által  indukált  tumorok jellemzô sajátsága, hogy a tumorokban olyan új vegyületek,  fôleg  aminosav-származékok  termelôdnek, melyek kizárólag csak ezekben a kóros szövetekben fordulnak elô. Ezeket a speciális aminosavakat összefoglaló néven opinoknak nevezzük. Ma már több mint 20 opinvegyületet ismerünk.  Az  opintermelés a tumort indukáló agrobaktérium által meghatározott. A tumoros növényi sejt az opinokat  a környezetbe  kiválasztja, és azokat a tumort indukáló baktérium képes szelektív tápanyagforrásként hasznosítani. Az opintermelés (a golyvás növényi szövetben),  illetve  hasznosítás  (az  indukáló baktérium által) az Agrobacterium nemzetség plazmidjainak jellemzô tulajdonsága (Dessaux és mtsai 1998). A plazmid típusának meghatározása mellett azonban a vélhetôen tumoros növényi szövetek opintartalmának elemzése esetenként  hasznos diagnosztikai  módszer is lehet. Ezek a vegyületek egyszerû laboratóriumi háttérrel, elektroforézissel olcsón és könnyen  kimutathatók, ezért növényegészségügyi alkalmazásuk  indokolt  lenne. 

A  korábbi  években  hét szôlôfajtáról  mintegy 90 tumormintát  gyûjtöttünk, különbözô  termôhelyekrôl.  Ezek  közül 85-ben  tudtunk kimutatni  A.  vitisre  jellemzô opinvegyületet. A tumormintákból izolált össz- DNS PCR analízise alapján a minták 85%-a volt mindkét tesztben pozitív (Szegedi 2003). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az opinteszt hasznos kiegészítô módszer lehet a szôlô agrobaktérium-fertôzöttségének bizonyításában. Szabadföldi körülmények között, ha ritkán is, de kialakulhatnak golyvaszerû tünetek a különbözô  sérülések, esetleg  hormonhatású  gyomirtó szerek alkalmazásának a következtében is. Szôlôoltványok  elôállításakor a gyökértörzs alapi részén és az oltási helyen gyakran képzôdnek különbözô méretû kalluszok, melyek vizuálisan nem mindig különíthetôk el egyértelmûen az agrobaktériumok indukálta tumoroktól. Ilyen esetekben az opinteszt hasznos kiegészítô módszer lehet, de használata a vegetációs idôszakra korlátozódik.  A  korhadó  fás  tumorokból ugyanis már nem lehet az opinokat kimutatni.


Szaporítóanyag-ellenôrzés: kimutatás egyéves fás vesszôkbôl

Az agrobaktérium-indexelés gyakorlat számára talán legfontosabb része a szaporításra, illetôleg oltványkészítésre használt egyéves fás vesszôkbôl történô kimutatás. A baktérium kinyerésére alapvetôen  két  módszer  lehetséges. Egyik a vesszôrészek homogenizálásán és szuszpendálásán  alapul.  Ennek során a feltárt növényi részekbôl (ízköz,  nódusz) izoláljuk  a baktériumot. A másik a vesszôátmosás módszere,  melynek  során a vesszôn túlnyomással (Tarbah és Goodman 1986) vagy  vákuummal (Ophel és mtsai 1988, Burr és mtsai 1989) steril vizet préselünk (szívatunk) keresztül, és az átmosatással kapott szövetnedvmintát szélesztjük táptalajon.

Ezeken kívül kinyerhetünk még szövetnedvet centrifugálással  is  (Burr  és  mtsai, 1988). Mindegyik módszer esetében nagyfokú korlátozó tényezô lehet az agrobaktérium-sejtszám jelentôs szezonális változása a növényben, továbbá, hogy a patogén agrobaktérium-sejtek feltehetôen  kötôdnek a gazdanövény  edénnyalábrendszerében a sejtfalakhoz.  Így  az  élô sejtek  kinyerésének  hatékonysága  sok  esetben nem  megfelelô.  A  szôlôszaporítóanyag-termesztés  kiindulási  anyaga  szinte  kizárólag  az egyéves, fás simavesszô, melyeket általában a kora  téli  idôszakban gyûjtenek  be,  és felületi fertôtlenítés  után  raktároznak.  A termesztéstechnológia szempontjából ezek  növényegészségügyi ellenôrzésére lenne a legnagyobb igény, ha a patogén megfelelô megbízhatósággal kimutatható lenne a vesszôkbôl.

Azt követôen, hogy Lehoczky János (Lehoczky 1968b, 1971) bizonyította az agrobaktérium szisztemikus terjedését a szôlôben, számos diagnosztikai célú vizsgálat történt a szôlôhajtások és vesszôk  fertôzöttségének a vizsgálatára. Goodman és mtsai a szôlôvesszôkbôl  vágott dugványokat  nyomáskamrába  helyezve az átmosás módszerével a félszelektív Roy-Sasser táptalajon izoláltak Agrobacterium spp.-t különbözô fajták érett, egészséges vesszôinek xylemjébôl. A kinyert telepek közül 36-ot  vizsgáltak  biokémiai  és patogenitás-tesztekkel. Ebbôl 31 bizonyult patogén A. vitis- nek (Tarbah és Goodman 1986). Eredményeik alapján az átmosással kimutatható a szôlôvesszôkben csekély koncentrációban és egyenetlen eloszlásban jelen  lévô agrobaktérium. További fontos eredményük annak bizonyítása, hogy a baktériumsejtszám a szôlôvesszôben a hajtáscsúcs felé haladva csökken, és a csúcsi rész már jelentôs mértékben mentes a fertôzéstôl. Ezekre az eredményekre alapozva elôállítható patogénmentes kiindulási anyag törzsültetvények létrehozására. Zölddugványozással szaporított szôlôben már csak az alapi részbôl tudtak kimutatni fertôzést, így ez a módszer még inkább alkalmas lehet a szôlô agrobaktérium-mentesítésére (l. alább). További kísérletekben zölddugványozással mintegy 200–200 gyökeres növényt  állítottak  elô  Catawba,  Seyval  blanc, Vidal blanc, Chancellor és Reliance fajták augusztusban gyûjtött hajtásaiból. Ugyanezen fajtákból fás dugványozással is hasonló mennyiségû növényt gyökereztettek meg. A szôlônövények vesszôinek agrobaktérium-tartalmát átmosással vizsgálták. A zöld hajtásból szaporított tételek fertôzöttsége lényegesen kisebb volt (0–10%), mint a fás dugványról hajtatott anyagé (0–53%).  Szabadföldrôl gyûjtött tünetmentes érett, fás vesszômintákból rendkívül nagy, mint- egy  60%-os fertôzöttséget állapítottak  meg (Goodman és mtsai 1987). 

Hirdetés

Ezeket a mintákat márciusban gyûjtötték Kaliforniában. Ekkor ott már  megindulhatott  a  nedvkeringés,  amivel együtt jár a baktérium felszaporodása a növény- ben. A zöld hajtásról szaporított növényekben való  esetenkénti  elôfordulás lehetséges oka, hogy az anyagot augusztusban hajtatták, amikor már megkezdôdik a lignifikáció. Ilyenkor a baktérium  már felvándorolhat  az  új  hajtásokba (Burr és mtsai 1988). Annak vizsgálatára, hogy a szôlô szabadföldi körülmények között milyen gyorsan fertôzôdik, négy szôlôfajta agrobaktérium-mentes egyedeit olyan „provokatív” területre ültették, ahol korábban golyvás Chancellor szôlôültetvény volt. A vizsgált növények 16 hónap után még mentesek voltak a fertôzéstôl, mivel a júliusban gyûjtött zöld hajtásokból az agrobaktérium nem volt kimutatható. Mintegy két év után (következô év április) gyûjtött könnyezésinedv-mintáknak viszont már mintegy 32%- a volt A. vitis-pozitív. Ugyanezen év októberében és decemberében gyûjtött vesszôkbôl a patogén viszont alig (mindössze 2%-ban) vagy egyáltalán nem volt kimutatható. A következô év  áprilisában  a  vizsgált  növényeknek ismét mintegy 25%-ában találtak agrobaktériumot (Pu és Goodman 1993b). Ennek alapján megállapítható, hogy a szôlôben a patogén sejtszáma jelentôs évi ciklikus változást mutat. A  tavasszal gyûjtött vesszôkbôl és könnyezési nedvbôl könnyen és nagy gyakorisággal kimutatható az agrbaktérium, ôsszel és télen viszont a vesszôkben rendkívül kicsi a sejtszám.

A szôlô könnyezési nedve nagy tápanyagtartalma következtében nyilvánvalóan optimális közeg az A. vitis és sok más baktérium felszaporodásához. Ezzel magyarázható, hogy a nedvkeringés megindulása után lényegesen könnyebb a patogén kimutatása szôlôbôl. A gyakorlatban azonban a téli fagyok miatt a vesszôket mindig ôsszel gyûjtik be, így a tavaszi minták tesztelése rutinszerûen nem alkalmazható.
 


Stover és mtsai (1997) mesterségesen fertôzött növények noduszainak homogenizálásával és szövetátmosással  nyerte  ki  a  szôlôvesszôk endogénbaktérium-tartalmát. A noduszok homogenizálásával a vizsgált mintáknak 12%-ából mutatta ki az agrobaktériumot, a fia- tal  hajtásokon  átpréselt  szövetnedvben  azon- ban nem talált patogént. Véleményük szerint a szövetátmosás  hatékonysága  nagyban  fokozható, ha a víz felszívatása után a vesszôdarabokat –20 oC-on fagyasztjuk, ezt követôen pedig két napig 28 oC-on inkubáljuk. Bár a fagyasztás hatására az izolált agrobaktériumszerû telepek száma nagyságrendekkel  növekedett,  a vizsgált 62 mintából bizonyíthatóan (szerológiai módszerrel) csak kettô tartalmazott A.  vitist. A folyadékfelszívatást követô  fagyasztás hasznossága megkérdôjelezhetô, mivel fagyasztás hatására az A. vitis sejtek jelentôs része elpusztulhat.
Lehoczky (1971) a felületileg  fertôtlenített vesszôkbôl rügydugványokat készített, ezt steril közegben hajtatta optimális hômérsékleten (23–28 oC), majd a frissen képzôdött kalluszokat és gyökereket homogenizálta és a mintákat megfelelô táptalajon szélesztette.

Ez a módszer, bár lényegesen idô- és munkaigényesebb, de az esetek  többségében  igen  eredményes.  Burr  és mtsai (1984, 1989) ezzel a módszerrel mintegy egy  nagyságrenddel  több  baktériumot  tudtak izolálni, mint a fentebb említett módszerekkel. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a nyugalmi állapotban lévô vesszôkben csekély a víztartalom, és nem áll rendelkezésre a baktériumok számára  hasznosítható  tápanyag  az  edény- nyalábrendszerben. A hajtatás során a dugvány a környezetébôl vizet vesz fel, beindul a szôlôben az anyagcsere, ami megfelelô tápanyagot nyújt a vesszôben kis koncentrációban jelen lévô baktériumok számára. Így ott a sejtszám nô, aminek  következtében  lényegesen könnyebbé válik az esetleges fertôzés kimutatása. Burr és mtsai  (1984)  fertôzött  tôkékrôl gyûjtött 187 vesszômintát hajtattak.

Ezek közül 30-ból mutatták ki az A. vitist (16%), és a vizsgált 417 telepbôl 131 (31%) volt patogén. A kísérletekhez a vesszômintákat  a  nedvkeringés  megindulása elôtt, februárban gyûjtötték.
Hazánkban  Németh  József  (Németh  1990) 29 tumoros és 25 tünetmentes tételbôl mintegy 2160 vesszôt dolgozott fel. A baktérium kinyerése céljából a vesszôket  nyomással  vagy  vákuummal átmosta, és az így nyert szuszpenziót használta a patogén kitenyésztésére. A tünetileg fertôzött  tôkékrôl  származó 29 tételbôl mindössze öt, a 25 egészséges tételbôl pedig két esetben tudott agrobaktériumot izolálni. A tumoros tôkékrôl gyûjtött vesszôknek mindössze 3,2%-a bizonyult fertôzöttnek, bár az egyes tételek között jelentôs eltérések voltak. Ezek az arányok arra  utalnak,  hogy nyugalmi  állapotban a vesszôkben nagyon kicsi a sejtszám, vagy az alkalmazott módszerek nem alkalmasak a patogén megfelelô érzékenységû diagnosztizálására. Lehoczky (1971) fertôzött Olimpia tôkékrôl gyûjtött egyéves, tünetmentes fás dugványokat kalluszosított, és a bazális részen képzôdött friss kalluszokat  használta kiindulási  forrásként  a patogén kimutatására. A vizsgált négy telepbôl egy volt patogén napraforgón. 

A fertôzés szisztemikus jellegének bizonyítására Lehoczky (1971) 25%-osnál nagyobb fertôzöttséget mutaó Olimpia szôlôfajta zöld hajtásait leoltotta tünetmentes 5C alanyra. Három év után a 120 fertôzött oltványból mindössze 8 növényen (6,7%) jelentek meg a tünetek, ami lényegesen kisebb a kiindulási anyag 25%-os fertôzöttségénél. Mivel  a  baktérium az  alanyban is elôfordulhat gyakran látensen  (Süle  1986,  Süle  és  mtsai 1994),  az agrobaktériumos fertôzés nemes- vagy alanyeredete nem bizonyítható.
Az agrobaktérium kimutatására Eastwell és mtsai (1995) a szôlô hajtásban történô sejtlízissel kinyert DNS-bôl PCR-re lényegesen hatékonyabban tudták  kimutatni  az  A. vitist, mint a baktérium kitenyésztésével. Ennek feltételezhetô oka, hogy a növényben lévô baktériumok jelentôs része nem mobilizálható, mivel azok a növényi sejtfalhoz  kötött  állapotban  vannak
(Cotado-Sampayo és mtsai 2001, Pu és Goodman 1993a).

Agrobaktérium-izolálás gyökérbôl

Az  agrobaktérium  elôfordulását  fertôzött szôlô tünetmentes gyökerében elôször Lehoczky  János  mutatta  ki.  Rekord szôlôfajta egyéves fás dugványait  nedves  környezetben gyökereztetve a fiatal gyökércsúcsokból öt telepet izolált, ezek közül egy volt patogén. Ugyancsak Rekord szôlôfajta egy-két éves gyökerein sebzéssel indukált  kalluszképzôdést,  és  a  friss kalluszokból  izolált  négy  telep  mind  patogén volt. Olimpia szôlôfajta gyökerein friss gyökerek gyökércsúcsaiból szintén eredményesen izolálta  az  agrobaktériumot  (Lehoczky  1971). További  kísérletekben  Olimpia  szôlôfajta  10 éves egyedeinek 13–16 mm átmérôjû (3–4 éves) gyökereinek  xyemjébôl 26 agrobaktériumszerû telepet izolált, melyek közül 11  volt patogén napraforgón. A vizsgált 9 gyökérmintából azonban csak 3 esetben talált agrobaktériu- mot, ami a patogén növényen belüli egyenetlen eloszlására utal. Elôzetes vizsgálatai alapján a gyökér  rezervoárként  szolgál  a  szôlôt  szisztemikusan fertôzô agrobaktérium-sejtek számára.

Tavasszal, a nedvkeringés („könnyezés”) megindulásakor  a  tápanyagdús  szövetnedvben  a baktériumok felszaporodnak, és a xylemtransz- porton keresztül elárasztják a növény föld feletti részeit, ahol belsô sérülések esetén megjelennek a tumorok (Lehoczky 1978). Süle (1986) ötéves, az alanyrészen tünetileg egészséges, de a nemes részen golyvás Merlot/5C tôkék gyökereinek agrobaktérium-tartalmát vizsgálta. A gyökérfelületen és a xylemben a patogén jelenléte nem volt kimutatható. A phloemból izolált telepek közül mintegy 12% (41-bôl öt) volt patogén.  További kísérletekben a begyûjtött gyökérmintákon laboratóriumi  körülmények között kalluszképzôdést indukált. A friss kalluszokból  izolált  baktériumtelepeknek viszont már mintegy 60%-a (a 98-ból 56) indukált tumorképzôdést a tesztnövényként használt napraforgón vagy paradicsomon. Ezek a kísérletek további bizonyítékot  szolgáltatnak  a  fertôzés szisztemikus jellegére, mivel a baktérium kimutatható volt a tünetmentes alanyból is. Az Egyesült Államokban Burr és mtsai szintén idôsebb ültetvényekbôl gyûjtöttek  gyökérmintákat.

A  fertôzött  tôkékrôl  származó  gyökerekbôl mindhárom esetben kimutatták a patogén jelenlétét, és a három tünetmentes tôkékrôl gyûjtött minta egyikébôl szintén izolálták a baktériumot. Ezt  követôen  további  vizsgálatokat  végeztek szaporítóanyag-iskolákból gyûjtött tünetmentes saját gyökerû és oltvány szaporítóanyagok gyökereinek analízisével. A 12 vizsgált növénybôl hét  esetben mutatták  ki  az  agrobaktériumot a gyökerekben és  gyökérfelszínen  (Burr  és mtsai 1987). Ez arra utal, hogy a gyökerek analízise hatékony eszköz lehet növényegészségügyi  diagnosztikai  vizsgálatokra.  Muscadina
(Vitis  rotundifolia)  szôlô  gyökereibôl  szintén nagy számban izoláltak agrobaktériumot, ezek
73%-a volt patogén (Thies és mtsai 1991). Vadon  élô  Vitis  ripariagyökerekbôl  kizárólag apatogén  A.  vitist  izoláltak,  melyek  túlnyomó többsége atipikusan nem hasznosította a tartarátot (Burr és mtsai 1999). Az A. vitis fennmaradása a szôlô gyökereiben mintegy két évig kimutatható volt (Burr és mtsai 1995). Ez egyben azt is jelenti, hogy golyvás ültetvény kitermelésekor ügyelnünk kell a gyökérzet minél teljesebb eltávolítására, mivel a talajban maradt gyökérmaradványokban túlélô A. vitis sejtek ismételt szôlôtelepítéskor kiindulási forrásként szolgál- hatnak  az  új  ültetvény  fertôzôdéséhez.  Ezek alapján a gyökérbôl történô izolálás, ha nem is 100%-os,  de  meglehetôsen  megbízható  mód- szernek  tûnik  a  látens agrobaktérium-fertôzés kimutatásához.  Ez  a  diagnosztikai  lépés  beilleszthetô a jelenlegi szaporítóanyag-termesztési technológiába,  a szôlôszaporítóanyag-iskolák kitermelését követô idôszakban.


A kimutatás és azonosítás módszerei

Az utóbbi években jelentôs fejlôdés történt az indexelési módszerek (negatív szelekció) területén is. A növényegészségügyi-diagnosztikai vizsgálatokban  a  hagyományos  eljárások  (a patogén izolálása és  azonosítása  biokémiai  és patogenitástesztekkel) mellett vagy azok kiegészítéseként, ma már egyre inkább elôtérbe került a modern molekuláris módszerek, mint például a polimeráz láncreakció alkalmazása (Louws és mtsai 1999, Moore és mtsai 2001).
Az agrobaktérium polimeráz-láncreakcióval (PCR) történô kimutatására elôször az Egyesült Államokban  (Dong  és  mtsai  1992),  majd  Németországban (Schulz és mtsai 1993) kezdôdtek el a vizsgálatok. A kezdeti kísérletek, melyekben laboratóriumi törzstenyészeteket használtak a  minta  DNS-izolálásához,  elsôdleges  célja  a megfelelô,  általánosan  alkalmazható,  patogénspecifikus  primerpárok  (20–25  bp  hosszúságú
„indítószekvenciák”)  meghatározása  volt. 

Hirdetés

Ennek megfelelôen a primereket virulenciagének vagy a T-DNS-en lévô onkogének szekvenciáinak alapján tervezték. Mivel a különbözô agrobaktérium törzsek Ti plazmidjain található virulenciarégió konzerváltabb, mint a T-DNS onkogénjei, ezért a vir-alapú primerek általánosabban használhatók, mint a Ti plazmid típusra lényegesen  jellemzôbb  onkogénspecifikus  primerek (Haas és mtsai 1995). A PCR reakcióhoz használt  primertôl  függôen  a  reakció  lehet fajspecifikus  is,  pl.  a kromoszomálisan  kódolt poligalakturonáz-génre  tervezett  primerek  alkalmazása A. vitis kimutatására és azonosítására (Eastwell  és  mtsai  1995,  Szegedi  és  Bottka 2002). Ezt követôen, illetve ezzel párhuzamosan elkezdôdtek a kísérletek az agrobaktériumos fertôzöttség növényi mintákból történô kimutatására is.

Ehhez alapvetôen két módszer használható,  úgymint  (1)  az  izolált  baktériumtelepek azonosítása  PCR-rel,  vagy  (2)  növénybôl  kinyert  össz-DNS  analízise.  Az  elôbbi  módszer lényegesen megbízhatóbb, de sokkal munkaigényesebb is. Mivel a növényi kivonatokban jelentôs mennyiségben fordulnak elô a PCR-reakciót gátló polifenolok és poliszacharidok, ezért alapvetô,  hogy  a  DNS  tisztítására  megfelelô módszert használjunk. Ilyenek például a többlépcsôs szerves extrakción alapuló izolálás vagy DNS-izoláló  oszlopok  használata  (Eastwell  és mtsai 1995, Cubero és mtsai 1999, Llop és mtsai 1999). 

Mint  már  említettük,  a  szôlôvesszôben történô in situ baktérium sejtlízist követôen közvetlen PCR-rel megbízhatóbban ki tudták mutatni a patogént, mint a vesszôn keresztülpréselt folyadékból  izolált  tenyészetek  felhasználásával  (Eastwell  és  mtsai  1995).  Ennek  feltehetô oka,  hogy  az  agrobaktérium-sejtek  túlnyomó többsége  a  szôlôsejtfalakhoz  kötött  állapotban van (Pu és Goodman 1993a, Cotano-Sampayo és mtsai 2001). A kötött sejtekbôl a lízis pufferben lévô detergens (SDS) kioldotta a DNS-t, így az  alkalmassá  vált  a  vizsgálat  számára,  míg  a xylem desztillált vizes átmosásával nem sikerült ezeket a baktériumokat mobilizálni. A növény- bôl való közvetlen kimutatás érzékenységének további  fokozására  a  módszer  kombinálható  a szerológiai  technikákkal  is  („immuncsapda”, Kauffman és mtsai 1996).

B) Szaporítóanyag tételek agrobaktérium-mentesítése

Az indexelés mellett az agrobaktériummentes szaporítóanyag elôállításának másik lehetôsége, amikor valamilyen eljárással elpusztítjuk a növényben lévô baktériumsejteket, vagy meg- felelô  szaporítástechnológiai  módszerrel  patogénmentes  anyagot  állítunk  elô.  A  fertôzés szisztemikus  jellege  miatt  a  kémiai  alapokon nyugvó  fertôtlenítés  nem  hatékony  (Lehoczky 1980), de vannak egyéb módszerek, melyekkel jelentôs  mértékben csökkenthetô  a szaporítóanyag tételek fertôzöttsége.


Hôkezelés

A hôkezelési eljárás lényege, hogy a szaporítóanyag-tételeket olyan, viszonylag magas hômérsékleten kezelik, mely még nem károsítja a növényi szöveteket, de már elpusztítja a kórokozókat és egyéb kártevôket. Erre a célra egy megfelelô, rendkívül pontos fûtésszabályozással és keverôvel  ellátott  vízfürdôt  használnak,  mely biztosítja,  hogy  a  víz  hômérséklete  a  tartály minden pontján egy-két tized fok pontossággal megfeleljen  a  beállított  értéknek.  Bár  hazánkban az eljárást még nem alkalmazzák a gyakorlatban, a hôkezelés alkalmazása szôlôszaporítóanyag-tételek  kezelésére  is  már  meglehetôsen régi múltra tekint vissza. Az elsô alkalmazások célja a filoxéra- és a fonálféreg-mentesítés volt, majd ezt követôen bizonyították, hogy hatékony a Pierce baktériummal (Xylella fastidiosa) és a Phytophthora  fajokkal  szemben  is  (Goussard 1977), valamint elpusztítja a szôlôrügyekben áttelelô   atkákat   (Dulinafka és mtsai 1995). Ezekívül a fitoplazma-mentesítésre is rendkívül hatékony, és ma már több országban általánosan alkalmazottá  vált  (Tassart-Subirats  és  mtsai
2003, Crocker és mtsai 2003).
 


Az A. vitis elleni alkalmazásra a 80-as évek végétôl került sor. Elsôként az USA-ban bizonyították,  hogy  az  A.  vitis  törzsek  50  oC-on 20–25 perc alatt elpusztulnak, de az A. tumefaciens törzsek ellenállók voltak ezzel a hôhatással szemben (Burr és mtsai 1989). Késôbb hasonló  jellegû  vizsgálatokat  végeztünk  Magyarországon különbözô opincsoportokba tartozó  A.  vitis  törzsek  bevonásával.  Ennek  során megállapítottuk,  hogy  az  opincsoportba  való hovatartozástól   függetlenül   az   oktopin-,   a nopalin- vagy a vitopintörzsek vizes szuszpenzióban lévô sejtjei teljesen elpusztultak egy 50 oC-on történô 30 percig tartó, hôkezelést követôen (Szegedi és Szécsi 1994). A 90-es évek elsô felétôl a közelmúltig különbözô laboratóriumokban számos kísérletet végeztek annak tisztázására, hogy a hôkezelés alkalmas-e szôlôszaporítóanyag-tételek  szisztemikus  A.  vitis-fertôzöttségének  a  megszüntetésére.  A  kísérletek során nyugalmi állapotban lévô alany- és nemes vesszôket áztattak 50–52 oC-on, 30–60 percig. Ez a kezelés, néhány esettôl eltekintve, általában nem ártott a szôlôrügyeknek, és nem befolyásolta az oltványkészítés szempontjából alapvetô fontosságú kalluszosodást.

Ez a kezelés je- lentôs  számban  gyéríti  a  szôlôvesszôben  lévô látens A. vitis fertôzést, de – ellentétben a labo- ratóriumi  vizsgálatok  eredményeivel  –  in  vivo nem pusztítja el teljes mértékben az agrobaktérium-sejteket  (Bazzi  és  mtsai  1991,  Burr  és mtsai   1989,   1996,   Ophel   és   mtsai   1990, Mahmoodzadeh és mtsai 2003). A laboratóriu mi és a szabadföldi kísérletek eredményei közötti különbség okát nem ismerjük. Annak elle- nére,  hogy  a  hôkezelés  az  agrobaktériummal szemben  nem  100%-os  hatékonyságú,  a  módszer   bevezetése   és   alkalmazása   általános növényegészségügyi kezelésként az egyéb pozitív hatások (fitoplazma- és atkamentesítés) miatt is megfontolandó.

Zölddugványozás és zöldoltás

Tarbah  és  Goodman  (1986)  megfigyelései alapján az egyéves érett, fás vesszôkben az alapi résztôl a hajtáscsúcs felé haladva folyamatosan csökken az agrobaktérium-sejtszám, sôt a veszszôk apikális része már jelentôs mértékben mentes volt a látens fertôzéstôl. Szintén az Egyesült Államokban Chenin blanc, Pinot Chardonnay és Rizling  fajták  hajtásainak  (internódium)  agrobaktérium-tartalmát vizsgálták május és október között. Az internodiális szakaszokban augusztus  elejéig  a  patogén  nem  volt  detektálható,  a baktérium  csak  augusztus  végétôl  jelent  az  új hajtásokban, szintén elsôsorban a vesszôk alsó részében. A baktérium felvándorlása az idôsebb fás részbôl a fiatal új hajtásokba feltételezhetôen a  lignifikációt  követôen  a  másodlagos  xylem kialakulásával áll összefüggésben, mivel ez biztosítja a folyamatos fizikai kapcsolatot az idôsebb fás részek és az újonnan képzôdött hajtások között (Burr és mtsai 1988).

Magyarországon  Cabernet  sauvignon,  Rajnai  rizling,  Irsai Olivér és Téli  muskotály  szôlôfajták  tünetileg egészséges és golyvás tôkéirôl május végén és július elején gyûjtöttek be zöld hajtásokat. Fajtánként 10–10 hajtást vizsgáltak baktériumtartalomra  a  felsô  hat  és  az  alapi  internódiumban mindkét idôpontban. A felsô hat apikális internódiumban sem május végén, sem július elején nem volt kimutatható az A. vitis jelenléte. Az alsó részben viszont júliusban már megjelent az agrobaktérium (Szegedi és Németh 1996). Ezek az  eredmények  megegyeznek  Burr  és  mtsai (1988)  megfigyeléseivel,  és  azt  bizonyítják, hogy a vegetációs idôszak elsô felében a fiatal hajtások még mentesek a szisztemikus agrobaktérium-fertôzéstôl.

Erre további közvetett bizonyíték, hogy a vegetációs idôszakban a zöld hajtásokon sohasem figyelhetô meg tünet, pedig a hajtásválogatással, csonkázással okozott nagyszámú sérülés elvileg kedvezne a tumorok megjelenésének. A nyár eleji zöldmunkák idején  viszont a fiatal, fogékony hajtásokban még nincs jelen a baktérium.
Ezekre  a  megfigyelésekre  alapozva  fiatal zöld hajtásokból nyert gyökeresített zöld dugványok felhasználásával vagy a zöldoltás alkalmazásával  feltételezhetôen  jelentôs  mértékben csökkenteni  lehetne  az  agrobaktériumos  fertôzés szaporítóanyaggal való terjedését. A laboratóriumi hátteret igénylô és költségesebb in vitro technika mellett a szôlô zöld hajtásokról történô szaporítása alkalmas alternatív eljárás lehet agrobaktérium-mentes szaporítóanyag  tömegeselôállítására.  Annak  ellenére,  hogy  a  zöldsza- porítás módszere a hazai és nemzetközi gyakor- latban   ismert   (Baglyas   2003,   Thomas   és Schiefelbein  2004),  széles  körben  sajnos  még nem terjedt el.

In vitro szaporítás


Az így fölnevelt növények teljes mértékben mente- sek  voltak  agrobaktériumtól.  Thies  és  Graves (1992)  különbözô  Vitis  rotundifolia  Michx. (muscadina  szôlôfajták)  genotípusok  0,2–0,4 mm-es hajtáscsúcs-merisztémáiból in vitro növényeket regenerált. Az így fölnevelt növények közül mintegy 200-at teszteltek agrobaktériumra, ezek mindegyike szintén mentes volt. Az in vitro  módszerrel a Pierce-betegséget  okozó Xyllela fastidiosa baktériumot is sikeresen eliminálták (Robacker és Chang 1992). Az Egyesült   Államokban hajtáscsúcstenyészetekkel elôállított  és  felszaporított  növényekbôl  létrehoztak egy szôlôültetvényt olyan területen, ahol korábban  sohasem  volt  szôlô.  Az  ültetvény,  a hideg éghajlati viszonyok ellenére is, hét év után még  mindig  mentes  volt  a  golyvától  (Burr  és mtsai 1998).


Köszönetnyilvánítás

A szerzôk köszönetüket fejezik ki a Földmûvelésügyi  és  Vidékfejlesztési  Minisztérium (FVM) 151-a1/2002 számú, valamint az Országos Tudományos Kutatási Alap (OTKA) T042465 számú támogatásáért.

 

Patogénmentes szaporítóanyag elôállítására a hôkezeléskor és a zölddugványozáskor a labo- ratóriumi háttér szükségessége miatt költsége- sebb,  de  lényegesen  megbízhatóbb  módszer  a szôlô in vitro szaporítása. A tenyészetek indítá- sa történhet hajtáscsúcsokból, vagy hajtáscsúcs- merisztémákból. A kiindulási anyagként hajtás- csúcsok ugyanis még mentesek a szisztemikus baktériumfertôzéstôl, és ezeket leoltás elôtt fe- lületileg is fertôtlenítik, ami további biztonsági tényezô. A növényi anyag esetleges fertôzöttsé- ge könnyen ellenôrizhetô, de ha elôfordul is, az a  növények  felszaporítása  (átoltások)  során  a táptalajon  általában  megjelenik.  Burr  és  mtsai (1988) Pinot Chardonnay szôlôfajta fertôzött és egészséges  tôkéinek  vesszôit  üvegházban  hajtatta, és a zöld hajtások mintegy két cm-es hajtáscsúcsaiból indított in vitro tenyészeteket.

Forrás: Növényvédelem

Ha tetszett ez a cikk, oszd meg ismerőseiddel, kattints ide:

MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS

Ezek is érdekelhetnek

Hirdetés

felületi öntözés

az olyan öntözési mód, amelynél az öntözővíz a talaj felszínén mozogva jut el a talaj... Tovább

főkönyv

olyan nyilvántartás, amelyben a gazd. műveleteket időrendben, a könyvviteli számlák... Tovább

Tovább a lexikonra
Hirdetés
IRATKOZZ FEL A HÍRLEVELÜNKRE!X
Érdekelnek a legfrisebb iparági hírek, legújabb blogbejegyzéseink?


A 'FELIRATKOZOM A HÍRLEVÉLRE' gomb megnyomásával hozzájárulást adsz a hírlevelek fogadásához és elfogadod az Adatvédelmi Szabályzatunkat.