Az antagonista hatásáról ismert Trichoderma hamatum 42 kDa-os endokitinázát kódoló gént transzformáltuk dohánynövényekbe. A kitinázok a gombák sejtfalában található kitint hidrolizálják, így a transzg

Hirdetés

Trichoderma endokitináz gén felhasználása szürkepenész-ellenállóság kialakítására

Kálai Katalin, Giczey Gábor, Dénes Ferenc, Balázs Ervin és Mészáros Annamária
Hirdetés

Iratkozz fel Te is Youtube csatornánkra, kattints az alábbi YOUTUBE ikonra! 

 

 

Az antagonista hatásáról ismert Trichoderma hamatum 42 kDa-os endokitinázát kódoló gént transzformáltuk dohánynövényekbe. A kitinázok a gombák sejtfalában található kitint hidrolizálják, így a transzgenikus vonalaknál megnövekedett toleranciát vártunk a gombás betegségekkel szemben. A szelektív táptalajon nôtt növények morfológiailag és élettanilag nem különböztek a vad típusú növényektôl. PCR tesztek bizonyították, hogy a felnevelt és vizsgált növények tartalmazták a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét. Az ellenôrzött körülmények között történô szürkepenészfertôzések során megállapítottuk, hogy a transzgenikus vonalak különbözô mértékû, de nagyobb toleranciát mutatnak a gombával szemben, mint a vad típusú növények. A vizsgált gén a második és harmadik utódnemzedékbôl is kimutatható volt.
Trichoderma endokitináz gén felhasználása szürkepenész-ellenállóság kialakítására, a Növényvédelem cikke

A gombák által okozott betegségek jelentôs terméskiesést okoznak, az ellenük való védekezés során kijuttatott vegyszerek pedig erôsen terhelik a környezetet. A rezisztens vagy toleráns fajták termesztésével csökkenteni lehetne a károkat. Hagyományos nemesítés során nehéz ilyen fajtákat elôállítani, de a biotechnológiai módszerek alkalmazásával már jó néhány sikeres kísérletet hajtottak végre. Az egyik legígéretesebb módszer, amikor olyan géneket fejeztetnek ki a növényben, amelynek a terméke vagy toxikus a kórokozó számára, vagy csökkenti annak növekedését. Ilyenek a hidrolitikus enzimek (kitinázok, glükanázok), gombák ellen ható fehérjék, antimikrobiális peptidek és a fitoalexinek termeléséért felelôs gének (Punja és mtsai 2001).


Több sikeres kísérletrôl számoltak be azokban az esetekben, amelyek során hidrolitikus enzimek génjeit fejezték ki a növényekben.
A hidrolitikus enzimek nagyon fontos szerepet játszanak a gombák elleni védekezésben, mert hidrolizálják a kitint, amely fontos alkotója nagyon sok növénykórokozó gomba sejtfalának.
Többféle élôlény termel kitináz enzimet, de különbözô minôségben és mennyiségben. A következô kísérletek során értek el megnövekedett rezisztenciát a gombás betegségekkel szemben: rizs-kitinázgént fejeztek ki krizantémban (Takatsu és mtsai 1999) és szôlôben (Yamamoto és mtsai 2000); baculovírus-kitinázgént dohányban (Shi és mtsai 2000); vad paradicsom kitinázgénjét termesztett paradicsomban (Tabaizadeh és mtsai 1999).


A legígéretesebb eredményeket akkor érték el, amikor Trichoderma fajok kitinázgénjeivel dolgoztak. A Trichodermák nemzetségébe tartozó gombák a biológiai növényvédelemben is ismertek. Az egyik legelsô közlemény, amelyben a Trichoderma-indukált rezisztenciáról írtak, azt mutatta be, hogy a Trichoderma harzianum gátolta a Botrytis cinerea csírázását babnövényeken (Zimand és mtsai 1996). Ebben a kísérletben közvetlenül használták fel a gombát, Lorito és mtsai (1998) azonban már úgy alakítottak ki rezisztenciát dohányban és burgonyában, hogy a Trichoderma harzianum endokitináz génjét fejezték ki a növényekben. Hasonló vizsgálatokat végeztek Bolar és mtsai (2001), Faize és mtsai (2003), Kikkert és mtsai (1998), akik szintén Trichoderma harzianumból származó endokitináz segítségével idéztek elô rezisztenciát almában és szôlôben.


A biológiai növényvédelemben azonban nemcsak a Trichoderma harzianum használható. Hazai kutatások során más Trichoderma fajokat is vizsgáltak. Fekete és mtsai (1996) a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét klónozták. Ezt a munkát Giczey és mtsai folyatták (1998), akik megnövelték a gén kópiaszámát a gombában, ezáltal annak kitinázaktivitása is megnövekedett. Úgy gondoltuk, hogy ennek a génnek a növényekben való kifejezése megnöveli a növény kitinázaktivitását, ezáltal toleranciát, esetleg rezisztenciát idézhetünk elô a transzgenikus vonalakban.
Mielôtt gazdaságilag fontos növények transzformálásába kezdtünk volna, egy modellnövényen, a dohányon teszteltük a rendszer alkalmazhatóságát.

Hirdetés

Anyag és módszer

 


A szelektív táptalajon nôtt növényeket polimeráz láncreakcióval (PCR) teszteltük, hogy megbizonyosodjunk arról, tartalmazzák-e a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét.
A gén egy 164 bp-os darabját felismerô primerpárt használtunk a vizsgálatokhoz. A felszaporított DNS-szakasz nukleotidsorrendjét meghatároztuk, és az ismert adatbázisokkal hasonlítottuk össze.
A fertôzési kísérletekhez olyan Botrytis cinerea törzset használtunk, amelyet fertôzött málnanövényrôl, szabadföldrôl gyûjtöttünk be, és burgonya-dextróz-agaron tartottunk fenn. A fertôzés különbözô módszerekkel, független kísérletek során, 2 ismétlésben történt: (1) az elôzetesen tûvel megsebzett levelekre gombamicéliumot tartalmazó agarkorongokat helyeztünk (1 korong/levél, 3 korong/növény), (2) a gomba szkleróciumát a növények talajára helyeztük, vagy (3) a sporuláló gomba táptalajáról steril desztillált vízzel lemosott spóraszuszpenziót permeteztünk a növényekre. Mindhárom esetben nagyon fontos körülmény volt a nagy páratartalom, illetve a 20 °C alatti hômérséklet.
Az elsô esetben a léziók nagyságát hasonlítottuk össze 2 nappal a fertôzés után, a másik két fertôzési mód során a fertôzöttség százalékát határoztuk meg a növény egészéhez viszonyítva, 2 héttel a fertôzés után. Kontrollként transzformálatlan növényeket használtunk.

Eredmények és következtetések

 



Megállapítottuk, hogy a fragmentum 100%-os homológiát mutat a Trichoderma hamatum endokitinázgénjének adatbázisban található szekvenciáival, de nem mutat homológiát növényi eredetû kitinázgénekkel.
A transzgenikus vonalakat Botrytis cinereával fertôztük. Az elsô fertôzési mód esetén – amikor gombamicéliummal átszôtt agarkorongokat helyeztünk a levelekre – megállapíthattuk, hogy a kontrollhoz képest kisebb léziók voltak megfigyelhetôk a transzformáns növényeken, kivéve a 7. vonalat, amelyen a kontrollhoz hasonló tüneteket figyeltünk meg.



A 8. és 9. vonal esetében nem alakultak ki tünetek (3. ábra).
A spóraszuszpenzióval permetezett növényeken keletkezett tüneteket 2 héttel a fertôzés után vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a 7. vonal itt is a legerôsebb tüneteket mutatta, a többi vonal esetében a fertôzöttség szintje alacsonyabb volt, mint a kontrollnövényé (4. ábra). Mindkét fertôzés során a 9. vonalnál lehetett a legenyhébb tüneteket megfigyelni.

Hirdetés



Érdekes megfigyelést tettünk abban a kísérletben, amelyben a gomba szkleróciumát helyeztük a növény talajára.
Abban az esetben, ha a gomba a növény szárát támadta meg, a növény elpusztult, függetlenül attól, hogy transzgenikus volt-e vagy sem. Ha azonban a növény levelét fertôzte meg, a 4. ábrán látható mértékben fertôzôdtek a növények. Ebbôl arra következtettünk, hogy a kitinázgén kifejezôdésének szintje a szárban jóval alacsonyabb, mint a levélben, ezért ott nem tud védelmet nyújtani a kórokozóval szemben. Ezt a hipotézist még további vizsgálatokkal kell megerôsítenünk.


Folyamatban van a transzgenikus vonalak kitinázszintjének vizsgálata. Ehhez olyan módszert kell kidolgoznunk, amellyel az egyes vonalak közötti kitinázaktivitás-különbségek kimutathatóak.
A módszer során el kell különítenünk a növényi eredetû és a gombából származó kitináz enzimeket is.
Növelnünk kell továbbá a kitinázgén kifejezôdését a szárban, hiszen sok növényen a szürkepenész éppen a növény szárán okozza a legveszélyesebb fertôzést. Ezt specifikus promóterek alkalmazásával érhetjük el.
Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy a Trichoderma hamatum endokitináz génjének segítségével olyan vonalakat állítottunk elô, amelyek a szürkepenész- (Botrytis cinerea) fertôzéssel szemben különbözô fokú, megnövekedett ellenállóságot mutatnak. Az eredmény nagyon ígéretes, és további finomítások után mindenképpen érdemes gazdaságilag fontos növényeken is alkalmazni. A kitinázgént termelô növények várhatóan nem csak a szürkepenész, hanem bármely kitin sejtfalú gombával szemben ellenállóbbak lesznek, ezáltal növényvédelmük környezetkímélôbbé válhat, hiszen termesztésük során kevesebb vegyszert kell használni.

Köszönetnyilvánítás

 

Kálai Katalin, Giczey Gábor
(Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2100 Gödöllô, Szent-Györgyi A. u. 4.)
Dénes Ferenc
(Fertôdi Gyümölcstermesztési Kutató-Fejlesztô Intézet Kht. 9435 Sarród, Kossuth u. 57.)
Balázs Ervin, Mészáros Annamária
(MTA Mezôgazdasági Kutatóintézete, 2462 Martonvásár, Brunszvik u. 2., Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2100 Gödöllô, Szent-Györgyi A. u. 4.)

 

Növényvédelem 41 (7), 2005

Forrás: Növényvédelem

Ha tetszett ez a cikk, oszd meg ismerőseiddel, kattints ide:

MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS MEGOSZTÁS

Ezek is érdekelhetnek

Hirdetés

oxigén (O)

a —>periódusos rendszer VI. a. csoportjába tartozó színtelen, szagtalan, vízben... Tovább

dongásság (mellkasszélesség)

a bordafal legtávolabbi pontjainak egymástól való távolsága, közvetlenül a lapocka... Tovább

Tovább a lexikonra
Hirdetés
IRATKOZZ FEL A HÍRLEVELÜNKRE!X
Érdekelnek a legfrisebb iparági hírek, legújabb blogbejegyzéseink?


A 'FELIRATKOZOM A HÍRLEVÉLRE' gomb megnyomásával hozzájárulást adsz a hírlevelek fogadásához és elfogadod az Adatvédelmi Szabályzatunkat.