Az antagonista hatásáról ismert Trichoderma hamatum 42 kDa-os endokitinázát kódoló gént transzformáltuk dohánynövényekbe. A kitinázok a gombák sejtfalában található kitint hidrolizálják, így a transzg

Trichoderma endokitináz gén felhasználása szürkepenész-ellenállóság kialakítására

Forrás: Növényvédelem

Az antagonista hatásáról ismert Trichoderma hamatum 42 kDa-os endokitinázát kódoló gént transzformáltuk dohánynövényekbe. A kitinázok a gombák sejtfalában található kitint hidrolizálják, így a transzgenikus vonalaknál megnövekedett toleranciát vártunk a gombás betegségekkel szemben. A szelektív táptalajon nôtt növények morfológiailag és élettanilag nem különböztek a vad típusú növényektôl. PCR tesztek bizonyították, hogy a felnevelt és vizsgált növények tartalmazták a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét. Az ellenôrzött körülmények között történô szürkepenészfertôzések során megállapítottuk, hogy a transzgenikus vonalak különbözô mértékû, de nagyobb toleranciát mutatnak a gombával szemben, mint a vad típusú növények. A vizsgált gén a második és harmadik utódnemzedékbôl is kimutatható volt.

A gombák által okozott betegségek jelentôs terméskiesést okoznak, az ellenük való védekezés során kijuttatott vegyszerek pedig erôsen terhelik a környezetet. A rezisztens vagy toleráns fajták termesztésével csökkenteni lehetne a károkat. Hagyományos nemesítés során nehéz ilyen fajtákat elôállítani, de a biotechnológiai módszerek alkalmazásával már jó néhány sikeres kísérletet hajtottak végre. Az egyik legígéretesebb módszer, amikor olyan géneket fejeztetnek ki a növényben, amelynek a terméke vagy toxikus a kórokozó számára, vagy csökkenti annak növekedését. Ilyenek a hidrolitikus enzimek (kitinázok, glükanázok), gombák ellen ható fehérjék, antimikrobiális peptidek és a fitoalexinek termeléséért felelôs gének (Punja és mtsai 2001).

Több sikeres kísérletrôl számoltak be azokban az esetekben, amelyek során hidrolitikus enzimek génjeit fejezték ki a növényekben.
A hidrolitikus enzimek nagyon fontos szerepet játszanak a gombák elleni védekezésben, mert hidrolizálják a kitint, amely fontos alkotója nagyon sok növénykórokozó gomba sejtfalának.
Többféle élôlény termel kitináz enzimet, de különbözô minôségben és mennyiségben. A következô kísérletek során értek el megnövekedett rezisztenciát a gombás betegségekkel szemben: rizs-kitinázgént fejeztek ki krizantémban (Takatsu és mtsai 1999) és szôlôben (Yamamoto és mtsai 2000); baculovírus-kitinázgént dohányban (Shi és mtsai 2000); vad paradicsom kitinázgénjét termesztett paradicsomban (Tabaizadeh és mtsai 1999).

A legígéretesebb eredményeket akkor érték el, amikor Trichoderma fajok kitinázgénjeivel dolgoztak. A Trichodermák nemzetségébe tartozó gombák a biológiai növényvédelemben is ismertek. Az egyik legelsô közlemény, amelyben a Trichoderma-indukált rezisztenciáról írtak, azt mutatta be, hogy a Trichoderma harzianum gátolta a Botrytis cinerea csírázását babnövényeken (Zimand és mtsai 1996). Ebben a kísérletben közvetlenül használták fel a gombát, Lorito és mtsai (1998) azonban már úgy alakítottak ki rezisztenciát dohányban és burgonyában, hogy a Trichoderma harzianum endokitináz génjét fejezték ki a növényekben. Hasonló vizsgálatokat végeztek Bolar és mtsai (2001), Faize és mtsai (2003), Kikkert és mtsai (1998), akik szintén Trichoderma harzianumból származó endokitináz segítségével idéztek elô rezisztenciát almában és szôlôben.

A biológiai növényvédelemben azonban nemcsak a Trichoderma harzianum használható. Hazai kutatások során más Trichoderma fajokat is vizsgáltak. Fekete és mtsai (1996) a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét klónozták. Ezt a munkát Giczey és mtsai folyatták (1998), akik megnövelték a gén kópiaszámát a gombában, ezáltal annak kitinázaktivitása is megnövekedett. Úgy gondoltuk, hogy ennek a génnek a növényekben való kifejezése megnöveli a növény kitinázaktivitását, ezáltal toleranciát, esetleg rezisztenciát idézhetünk elô a transzgenikus vonalakban.
Mielôtt gazdaságilag fontos növények transzformálásába kezdtünk volna, egy modellnövényen, a dohányon teszteltük a rendszer alkalmazhatóságát.

Anyag és módszer

A szelektív táptalajon nôtt növényeket polimeráz láncreakcióval (PCR) teszteltük, hogy megbizonyosodjunk arról, tartalmazzák-e a Trichoderma hamatum endokitinázgénjét.
A gén egy 164 bp-os darabját felismerô primerpárt használtunk a vizsgálatokhoz. A felszaporított DNS-szakasz nukleotidsorrendjét meghatároztuk, és az ismert adatbázisokkal hasonlítottuk össze.
A fertôzési kísérletekhez olyan Botrytis cinerea törzset használtunk, amelyet fertôzött málnanövényrôl, szabadföldrôl gyûjtöttünk be, és burgonya-dextróz-agaron tartottunk fenn. A fertôzés különbözô módszerekkel, független kísérletek során, 2 ismétlésben történt: (1) az elôzetesen tûvel megsebzett levelekre gombamicéliumot tartalmazó agarkorongokat helyeztünk (1 korong/levél, 3 korong/növény), (2) a gomba szkleróciumát a növények talajára helyeztük, vagy (3) a sporuláló gomba táptalajáról steril desztillált vízzel lemosott spóraszuszpenziót permeteztünk a növényekre. Mindhárom esetben nagyon fontos körülmény volt a nagy páratartalom, illetve a 20 °C alatti hômérséklet.
Az elsô esetben a léziók nagyságát hasonlítottuk össze 2 nappal a fertôzés után, a másik két fertôzési mód során a fertôzöttség százalékát határoztuk meg a növény egészéhez viszonyítva, 2 héttel a fertôzés után. Kontrollként transzformálatlan növényeket használtunk.

Eredmények és következtetések

Megállapítottuk, hogy a fragmentum 100%-os homológiát mutat a Trichoderma hamatum endokitinázgénjének adatbázisban található szekvenciáival, de nem mutat homológiát növényi eredetû kitinázgénekkel.
A transzgenikus vonalakat Botrytis cinereával fertôztük. Az elsô fertôzési mód esetén – amikor gombamicéliummal átszôtt agarkorongokat helyeztünk a levelekre – megállapíthattuk, hogy a kontrollhoz képest kisebb léziók voltak megfigyelhetôk a transzformáns növényeken, kivéve a 7. vonalat, amelyen a kontrollhoz hasonló tüneteket figyeltünk meg.

A 8. és 9. vonal esetében nem alakultak ki tünetek (3. ábra).
A spóraszuszpenzióval permetezett növényeken keletkezett tüneteket 2 héttel a fertôzés után vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a 7. vonal itt is a legerôsebb tüneteket mutatta, a többi vonal esetében a fertôzöttség szintje alacsonyabb volt, mint a kontrollnövényé (4. ábra). Mindkét fertôzés során a 9. vonalnál lehetett a legenyhébb tüneteket megfigyelni.

Érdekes megfigyelést tettünk abban a kísérletben, amelyben a gomba szkleróciumát helyeztük a növény talajára.
Abban az esetben, ha a gomba a növény szárát támadta meg, a növény elpusztult, függetlenül attól, hogy transzgenikus volt-e vagy sem. Ha azonban a növény levelét fertôzte meg, a 4. ábrán látható mértékben fertôzôdtek a növények. Ebbôl arra következtettünk, hogy a kitinázgén kifejezôdésének szintje a szárban jóval alacsonyabb, mint a levélben, ezért ott nem tud védelmet nyújtani a kórokozóval szemben. Ezt a hipotézist még további vizsgálatokkal kell megerôsítenünk.

Folyamatban van a transzgenikus vonalak kitinázszintjének vizsgálata. Ehhez olyan módszert kell kidolgoznunk, amellyel az egyes vonalak közötti kitinázaktivitás-különbségek kimutathatóak.
A módszer során el kell különítenünk a növényi eredetû és a gombából származó kitináz enzimeket is.
Növelnünk kell továbbá a kitinázgén kifejezôdését a szárban, hiszen sok növényen a szürkepenész éppen a növény szárán okozza a legveszélyesebb fertôzést. Ezt specifikus promóterek alkalmazásával érhetjük el.
Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy a Trichoderma hamatum endokitináz génjének segítségével olyan vonalakat állítottunk elô, amelyek a szürkepenész- (Botrytis cinerea) fertôzéssel szemben különbözô fokú, megnövekedett ellenállóságot mutatnak. Az eredmény nagyon ígéretes, és további finomítások után mindenképpen érdemes gazdaságilag fontos növényeken is alkalmazni. A kitinázgént termelô növények várhatóan nem csak a szürkepenész, hanem bármely kitin sejtfalú gombával szemben ellenállóbbak lesznek, ezáltal növényvédelmük környezetkímélôbbé válhat, hiszen termesztésük során kevesebb vegyszert kell használni.

Köszönetnyilvánítás

Kálai Katalin, Giczey Gábor
(Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2100 Gödöllô, Szent-Györgyi A. u. 4.)
Dénes Ferenc
(Fertôdi Gyümölcstermesztési Kutató-Fejlesztô Intézet Kht. 9435 Sarród, Kossuth u. 57.)
Balázs Ervin, Mészáros Annamária
(MTA Mezôgazdasági Kutatóintézete, 2462 Martonvásár, Brunszvik u. 2., Mezôgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, 2100 Gödöllô, Szent-Györgyi A. u. 4.)

Növényvédelem 41 (7), 2005